Hervorgegangen ist das Frankfurter Diakonissenhaus aus einer Initiative Frankfurter Gemeinden und hatte von Anfang an bis heute das Ziel, als diakonische Einrichtung mit verschiedenen Arbeitsbereichen und Ausbildungsstätten und durch Dienste in Gemeinden den diakonischen Auftrag der Kirche wahrzunehmen.
Initiator des 1861 gegründeten Diakonissenvereins zu Frankfurt am Main, 1. Vorsitzender und erster Hausgeistlicher war Pfr. Joh. Chr. Deichler, Peterskirche. Weitere Gründungsmitglieder, die sich auch als Vorstandsmitglieder des Vereins für Innere Mission Frankfurt engagierten, waren Pfr. Dr. Joh. Jak. Krebs, Dreikönigskirche, Pfr. Joh. Ludw. Schrader, deutsch-reformierte Gemeinde, Pfr. Dr. Jean L. Bonnet und Dr. jur. Ed. Souchay, sowie Amalie und Rosalie Gontard (französisch-reformierte Gemeinde), Christina Metzler (deutsch-reformierte Gemeinde) und Therese und Louise Lindheimer (lutherisch).
Der Diakonissenverein erhielt 1866 vom Senat der Freien Stadt Frankfurt die Vereinsrechte. Verein und Vereinsvorstand waren identisch; neue Mitglieder wurden auf Lebenszeit zugewählt. Mit der Satzungsänderung 1970 wurde der Name geändert in „Frankfurter Diakonissenhaus“, die Mitglieder des Vereins sind die eingesegneten Diakonissen.
1861 begannen Diakonissen aus dem Diakonissenhaus in Karlsruhe, denen sich andere Frauen anschlossen, den Dienst an kranken, alten und armen Menschen in Frankfurt a. M. Mit der Einführung der Oberin Marie Breitling am 8. Juni 1870 wurde die Diakonissengemeinschaft selbständig. Dieses Datum gilt als offizielles Gründungsdatum des Frankfurter Diakonissenhauses, auch wenn der Verein bereits im Jahre 1866 vom Magistrat der Stadt Frankfurt anerkannt wurde und schon 1861 gegründet worden war.
Die Diakonissengemeinschaft bezog 1874 an der Eschersheimer Landstraße 122 ein Mutterhaus mit Krankenhaus und Kapelle, in der öffentliche Gottesdienste und häusliche Andachten gehalten wurden, seit 1897 in der Diakonissenkirche.
1874 wurde Pfarrer Carl Leydhecker als Vorsteher berufen. Durch ihn und Oberin Natalie von Veltheim wurde das gottesdienstliche und das gemeinschaftliche Leben lutherisch geprägt, wobei die lutherische Reformbewegung (Pfr. Wilhelm Löhe, Neuendettelsau) starken Einfluss hatte. Das zeigte sich u. a. in der Gründung einer Paramentenwerkstatt (1883–2003) und einer Hostienbereitung (1885-2014).
In der Folgezeit nach 1874 entstanden auf dem Gelände Altenheime, Kindergarten, Hort und Ausbildungsstätten für Krankenpflege und Sozialpädagogik. Viele Schwestern arbeiteten in der Gemeindekrankenpflege, in Kindergärten und Frauen- und Jugendgruppen, sowie im Erziehungsheim Elisabethenhof in Marburg/Lahn. Im 2. Weltkrieg wurden die Kirche und mehrere Gebäude zerstört. Nach ihrer Ausweisung 1945 durch die US-Besatzungsmacht kehrten sie 1955 in ihr Gelände zurück.
Das Frankfurter Diakonissenhaus ist heute als Verein alten Rechtes organisiert. Ein Vorstand, bestehend aus der Oberin Diakonisse Heidi Steinmetz und dem kaufmännischen Geschäftsführer, leiten das Haus. Pfarrer Alexander Liermann, mit halber Stelle am Diakonissenhaus, und Pfr. Jeffrey Myers, der mit geringerer Stundenzahl unterstützt, sind die Theologen, Seelsorger und Hauptliturgen am Haus.