Das Diakonissenhaus nutzte für die Ausbildung der Krankenschwestern seine bestehenden Ressourcen. Der Hausarzt war für die Behandlung der Kranken verantwortlich und übernahm zugleich die wöchentliche Unterweisung und Anleitung der Diakonissen, insbesondere der Probeschwestern. Die Ausbildung dauerte zunächst ein halbes Jahr und konnte gegen Gebühr auch von externen Krankenschwestern absolviert werden. Bei den Lehrkräften handelte es sich um renommierte Frankfurter Ärzte mit umfassender Berufserfahrung; viele von ihnen gehörten dem Vorstand an. (6)
Im Jahr 1907 trat eine Ausbildungsverordnung des Preußischen Bundesrats in Kraft, die sowohl die Inhalte als auch die Prüfungen in der Krankenpflege regelte und die Ausbildungsdauer auf ein Jahr festlegte. (7) Das Diakonissenhaus passte sich diesen Vorgaben an und verlängerte ab 1909 die Ausbildung auf ein Jahr. Die obligatorischen Krankenpflegeexamen wurden im Haus von Prüfern aus Wiesbaden gemeinsam mit den Hausärzten abgehalten. In den ersten Jahren waren dabei zudem regelmäßig Vorstandsmitglieder anwesend. 1909 wurde die erste staatliche Krankenpflegeprüfung durchgeführt.
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurde das Diakonissenkrankenhaus um einen neuen Operationsflügel sowie zusätzliche Krankensäle und -zimmer erweitert. Die verbesserte Ausbildung, die gesteigerte Aufnahmekapazität und die günstige Lage am Stadtrand, die als besonders gesundheitsfördernd galt, verschafften dem Haus großes Renommee unter den städtischen Krankenanstalten. (8)
Bereits der Jahresbericht von 1876 hatte das breite und anspruchsvolle Ausbildungsspektrum hervorgehoben: „Wir freuen uns, nunmehr den Grundsatz, keine Schwester vor Ablauf des ersten Probejahres außer dem Hause zu beschäftigen, pünktlich durchführen und so den jüngeren Schwestern Gelegenheit bieten zu können, nach allen Seiten hin die nötige Ausbildung zu erlangen. Dies beschränkt sich nicht auf das Warten der Kranken oder auf die Fertigkeiten in der Haus- und Küchenarbeit, die bei vielen Pflegen erforderlich ist. Sie umfasst den ärztlichen Unterricht, den allgemeinen Unterricht und namentlich die Unterweisung aus Gottes Wort; denn wir bilden hier nicht nur Krankenpflegerinnen, sondern Diakonissen, das sind Dienerinnen Jesu an seiner Gemeinde in deren hilfsbedürftigen – und nicht etwa nur kranken – Gliedern.“ (9)